Виктория матросова: Victoria Matrosova | Facebook

Содержание

Персонал кафедры — Кафедра Економіки бізнесу і міжнародних економічних відносин

  Перерва Петр Григорьевич

заведующий кафедры,  профессор, доктор экономических наук

 

Кучинский Владимир Анатольевич
доцент, кандидат экономических наук, первый заместитель заведующего кафедры  
Погорелова Татьяна Алексеевна
доцент, руководитель экономической секции, заместитель заведующего кафедры по учебной работе 
Маслак Мария Владимировна
доцент, кандидат экономических наук, заместитель заведующего кафедры по научной работе
 
Черепанова Виктория Александровна
профессор, кандидат экономических наук, заместитель заведующего кафедры по методической работе 
Савченко Ольга Игоревна
профессор, кандидат экономических наук,  заместитель заведующего кафедры  по международной деятельности

перечень научных работ

 

 

Кобелева Татьяна Александровна
профессор, доктор экономических наук, заместитель заведующего кафедры по воспитательной работе
 
Новик Ирина Алексеевна
доцент, кандидат экономических наук, заместитель заведующего кафедры по профориентационной работе 
Матросов Александр Дмитриевич
профессор, кандидат экономических наук, почетный член кафедры
 
Долина Ирина Владимировна
профессор, кандидат экономических наук 
Дюжев Виктор Геннадиевич
профессор, доктор экономических наук 
Косенко Андрей Васильевич
профессор, кандидат экономических наук 
Матросова Виктория Александровна
профессор, кандидат экономических наук

перечень научных работ

 

 

Погорелов Сергей Николаевич
профессор, кандидат экономических наук

перечень научных работ

 

 

Посохов Игорь Михайлович
профессор, доктор экономических наук
перечень научных работ
 
Шматько Наталия Михайловна
профессор, доктор экономических наук
 
Глизнуца Марина Юрьевна
доцент, кандидат экономических наук
Гуцан Александр Николаевич
доцент, кандидат экономических наук
 
Карминская-Белоброва Марина Владимировна
доцент, кандидат наук по государственному управлению, заместитель заведующего кафедры по заочному обучению
 
Крамской Дмитрий Юрьевич
доцент, кандидат экономических наук, научный руководитель учебной лаборатории ВТ 
Пантелеев Михаил Сергеевич
доцент, кандидат технических наук 
Побережный Роман Олегович
доцент, кандидат экономических наук 
Попов Николай Алексейович
доцент, кандидат экономических наук
 
Проскурня Елена Михайловна
доцент, кандидат технических наук

перелік наукових робіт

 

Синиговец Ольга Николаевна
доцент, кандидат экономических наук 
Сусликов Станислав Вячеславович
доцент, кандидат экономических наук

перечень научных работ

 

Тимофеева Екатерина Александровна
доцент, кандидат экономических наук 
Верютина Виктория Юрьевна
старший преподаватель
 
Дьякова Наталья Николаевна
старший преподаватель
 
Колотюк Елена Ивановна
ассистент кафедры
 
Передрий Андреа Элизабет Юрьевна
ассистент кафедры
 
Сапронов Александр Васильевич
ведущий инженер
Круглов Александр Анатольевич
заведующий учебной лабораторией ВТ
Локтионова Татьяна Петровна
заведующая учебной библиотекой,
инженер 1-й категории
tetiana. [email protected]
Величко Татьяна Константиновна
инженер 1-й категории
Гонкина Светлана Алексеевна
инженер 1-й категории
Побережная Екатерина Викторовна
инженер 1-й категории
 
Солодовникова Татьяна Владимировна
инженер 1-й категории

Отель Виктория, Дудинка – цены гостиницы, отзывы, фото, номера, контакты

В какое время заезд и выезд в Отеле «Виктория»?

Заезд в Отель «Виктория» возможен после 12:00, а выезд необходимо осуществить до 12:00.

Сколько стоит проживание в Отеле «Виктория»?

Цены на проживание в Отеле «Виктория» будут зависеть от условий поиска: даты поездки, количество гостей, тарифы.

Чтобы увидеть цены, введите нужные даты.

Какие способы оплаты проживания предусмотрены в отеле?

Способы и сроки частичной или полной предоплаты зависят от условий выбранного тарифа. Отель «Виктория» принимает следующие варианты оплаты: Visa, Euro/Mastercard, No creditcards accepted, only cash, American Express.

Есть ли скидки на проживание в номерах «Виктория»?

Да, Отель «Виктория» предоставляет скидки и спецпредложения. Чтобы увидеть актуальные предложения, введите даты поездки.

Какой общий номерной фонд у Отеля «Виктория»?

В Отеле «Виктория» 22 номера.

Какие категории номеров есть в Отеле «Виктория»?

Для бронирования доступны следующие категории номеров:
Одноместный (Одноместный номер)
Студио (Номер-студио)

Телемагия заставила шевелиться грудь известной визажистки

XXI век, казалось бы, уже надежно вступил свои права. В эру стремительного развития технологий в современном мире практически не осталось явлений, которым ученые не нашли бы рационального объяснения. Однако мир вокруг нас, если присмотреться, по-прежнему полон тайн и необъяснимых загадок.

Одно из таких явлений могли наблюдать зрители популярной программы «Акценты», выходящей на телеканале «МИР 24». Во время эфира, посвященного пластической хирургии, вопреки законам физики и земной гравитации у нашей гостьи внезапно начала двигаться грудь. Очаровательная Виктория Матросова, которая не в первый участвует в программе, казалось, сама была удивлена таким поворотом событий.

Пусть злопыхатели и завистники твердят, что на телевидении все неправда – мы готовы ответственно заявить – может быть, режиссер программы втайне и мечтал приложить руки к этому чудесному происшествию, но даже под пытками он отказался в этом сознаться.

Пожимают плечами и физики, к которым мы обратились с просьбой разъяснить природу этого явления. Завороженно глядя в экран телевизора, именитые ученые начинают терять самообладание и все как один твердят, что познали настоящую красоту, а в науку больше не верят. Если уж и этот факт не сможет убедить

астролога Нахата Пунита Сантошкумара в том, что на телевидении творится настоящая магия, то, наверное, не сможет ничто.

Дабы не обманывать телезрителя – признаемся честно – мы и сами не до конца понимаем, что же именно произошло в тот день в студии. Предлагаем вам самим взглянуть и сделать выводы, что же это – происки полтергейста, зрительный обман или что-то другое.

Социальная сфера и устойчивое развитие городских территорий — Чешский журнал социальных наук, бизнеса и экономики — Том 3, выпуск 2 (2014) — CEJSH

Социальная сфера и устойчивое развитие городских территорий — Чешский журнал социальных наук, бизнеса и экономики — Том 3, Выпуск 2 (2014) — CEJSH — Yadda

EN

Статья посвящена проблеме анализа качества социальных услуг в городах, как важному фактору устойчивого развития городской среды. Социальная сфера — основа эффективной жизни человека, невнимание к социальным проблемам при формировании стратегических приоритетов развития урбанизированных территорий может привести к ухудшению здоровья, увеличению потерь рабочего времени и снижению конкурентоспособности регионов в межрегиональном пространстве. мобильность рабочей силы. В ходе исследования рассматриваются факторы формирования благоприятной социальной сферы города, выделяются подходы к их анализу и оценке, определяется степень их влияния на устойчивое развитие городских территорий.В результате исследования в данной статье представлена ​​система показателей социальной напряженности, учитывающая опыт оценки социального благополучия школы Кембриджского университета и отражающая отношение населения к своим потребностям и потребностям. существующие социальные институты, а также рекомендации по определению пороговых значений соответствующих показателей. Предлагаемая система показателей позволяет анализировать социальную эффективность и делать объективный выбор направлений и проектов развития городских территорий с учетом их социальной значимости.

  • Redakce CJSSBE, Univerzitní servis, s.r.o., Trnkovo ​​nám. 1112/2, 152 00 Praha 5, Чешская Республика

Номер заказа на публикацию

bwmeta1.element.desklight-a0d9ea8a-8359-4019-84db-84979ef6580d

В вашем браузере отключен JavaScript. Включите его, чтобы в полной мере использовать возможности этого сайта, затем обновите страницу.

Список деканов | Регистратор | Юго-Западный государственный колледж Флориды

Перейти к основному содержанию Ресурсы по COVID-19 Сообщить о случаях COVID-19 Применять Контакт Портал Холст Пожертвовать Каталог Предупреждение FSW
  • Будущие студенты
  • Новые студенты
  • Нынешние студенты
  • Сотрудники факультета
  • Календарь событий
  • Быстрые ссылки Академический календарь Академическая поддержка ADAptive Services Arts @ FSW легкая атлетика Книжный магазин BOT Встречи Карта BUC Карты кампуса Полиция кампуса Университетские средние школы Двойная регистрация Услуги по организации мероприятий Удобства FSW Secure Служба поддержки Человеческие ресурсы Международное образование Вакансии Библиотека Контакты для СМИ Новости Онлайн-программы Оплата колледжа Виртуальный день открытых дверей
  • Дом
  • Регистратор
  • Список деканов
Домашняя страница регистратораСправочник отделаЗапрос Официальные стенограммыЛетний 2021 Отслеживание успеваемостиАвтоматический выпуск и церемония поступления

Список деканов, весна 2020 года

Просмотр текущего

А-Е

F-L

M-R

S-Z

Архив

  • Список деканов на осень 2020
  • Список деканов на весну 2020
Charlotte Campus
26300 Airport Rd
Punta Gorda, FL

(941) 637-5629 Collier Campus
7505 Grand Lely Dr
Неаполь, Флорида

(239) 732-3700 Lee Campus
8099 College Pkwy
Fort Myers, FL

(239) 489-9300 Hendry Glades
1092 E Cowboy Way
LaBelle, FL

(863) 674-0408 Центр корпоративного обучения
27400 Riverview Center Blvd. Suite 2
Bonita Springs, FL

(239) 432-7313 Телетайп: 1-800-955-8771 или 711 Facebook Твиттер Instagram YouTube
  • Исполнительные офисы
  • Вакансий
  • Безопасность кампуса
  • Аккредитация
  • Равные возможности
  • Политика конфиденциальности
  • Запрос публичной записи
  • Информация для потребителей
  • Доступность
  • © ЖСБ 2014-2021.Все права защищены.

Кейт Матросова найдена мертвой в морозных условиях в горах Нью-Гэмпшира

Инвестиционный банкир, найденный мертвым после попытки подняться на высочайшую вершину Северо-Востока, использовал сломанный аварийный маяк и мог бы спастись, если бы включил свой мобильный телефон, утверждают спасатели.

32-летняя Кейт Матросова высадилась со своим мужем Чарли Фархуди у подножия горы Мэдисон протяженностью 5400 футов в Нью-Гэмпшире в 5 утра в прошлое воскресенье.

Через несколько часов она активировала аварийный маяк среди метели, но команда не смогла найти ее в метели, потому что альпинисты говорят, что минусовые температуры не позволяют ему работать должным образом.

Ее тело было обнаружено 24 часа спустя, когда аварийная техника отправила спасателей в неправильном направлении. Другие говорили, что с ее стороны было «небрежно» находиться там, и ее решения показали ее «неопытность».

Трагедия: 32-летняя кредитная компания BNP Paribas Кейт Матросова была найдена мертвой через 24 часа после того, как она позвала о помощи, когда поднималась на гору Мэдисон

Замужем: Матросову высадил на стрельбище в 5 утра в воскресенье муж Чарли Фархуди (слева). ), который указан в LinkedIn как вице-президент JP Morgan.Пара делила квартиру за 1 миллион долларов на Манхэттене

Чрезвычайная ситуация: поисковая группа не смогла найти Матросову (на снимке в январе) в течение 24 часов после ее звонка

Когда она активировала устройство слежения, оно мгновенно сработало в ВВС Тиндаля. База в Панама-Сити, Флорида.

Операторы набрали номер, связанный с учетной записью, но он сразу перешел на голосовую почту, потому что ее телефон был выключен.

Это означало, что никто не набирал 911, пока с ее мужем, который в то время сидел в своем гостиничном номере, не связались сотрудники базы во Флориде.

Горный спасатель-волонтер Стив Ларсон сказал Boston Globe, если бы у них было правильное местоположение Мастровой, они бы не тратили часы, путешествуя по лесу в неправильном направлении.

«Один урок из всего этого, для всей этой потрясающей технологии, она явно не точна», — сказал он.

Лейтенант Уэйн Сондерс сказал, что ее маяк был разработан для работы при температурах до минус 20.

Но он сказал, что воздух был намного холоднее, а это значит, что это могло обмануть технологию.

Майк Пелчат, сотрудник государственного парка, добавил: «Возможно, она слишком сильно полагалась на технологию. Может, она думала, что сможет вернуться. Но температура и ветер взяли верх ».

Макс Лурье, 28 лет, который ответил на второй звонок горноспасательной службы, сказал Globe: «Было холодно — одна из самых холодных ночей в году — и дул ветер. Я не хожу туда, когда есть такие условия.

‘Она попала туда по небрежности.Ее решение явно говорит о ее неопытности ».

Изнурительно: на гору Мэдисон (на фото без Матросовой) в воскресенье ночью обрушился ветер со скоростью 100 миль в час и метель.

Она пыталась подняться на Президентский хребет Белых гор, который включает самую высокую вершину на северо-востоке. Гора Вашингтон — высота 6300 футов

Родившаяся из России Матросова, которая жила в квартире за 1 миллион долларов в Мидтауне Манхэттена с Фархуди, планировала подняться на вершину Мэдисона, прежде чем отправиться на три других вершины так называемого Президентского хребта. .

По мере того, как день прогрессировал, в регион обрушился ветер, скорость которого превышала 100 миль в час, а температура упала до -30F.

Кредитный трейдер BNP Paribas отправил свои координаты спасателям в воскресенье днем.

После неудачной попытки в воскресенье экипаж Национальной гвардии в понедельник утром пролетел над этим районом на вертолете, но ничего не увидел из-за метели и вынужден был повернуть назад.

«К сожалению, многие координаты, которые мы получили за ночь, находились повсюду в радиусе мили», — сказал Fish and Game Lt.Джим Госс сообщил WMUR-TV.

Маунт Мэдисон является частью серии встреч на высшем уровне, названных в честь президентов и других выдающихся американцев, которые вместе называются Президентским хребтом.

Она была найдена между горами Мэдисон и Адамс (вверху справа), предположительно умерла от холода

Планы: Власти говорят, что Матросова планировала самостоятельно подняться на все четыре вершины Президентского хребта

Матросова, чья полное имя — Екатерина, родом из Омска, Россия, до переезда в Чикаго на учебу в 2002 году

Facebook Матросовой показал, что она очень активна, с многочисленными фотографиями походов и рафтинга

Согласно WMUR-TV, Матросова ехала пройти через гору Адамс, гору Джефферсон и гору Вашингтон после достижения вершины горы Мэдисон.

Ее нашли между горами Мэдисон и Адамс.

Команда, состоящая из офицеров рыбной ловли, сотрудников горноспасательных служб и поисково-спасательных служб Андроскоггин-Вэлли, выдержала ветер со скоростью 108 миль в час и низкие температуры, чтобы добраться до этого места.

«Думаю, если вы собираетесь отправиться в поход в такую ​​погоду, вам нужно находиться в более защищенном месте, а не на открытой открытой хребте», — сказал Госс. «В таком месте просто нет права на ошибку».

Считается, что Матросова, полное имя которой — Екатерина Матросова, родом из Омска в России до переезда в Чикаго на учебу в 2002 году.

В 2006 году она получила степень бакалавра наук по специальности финансы и маркетинг в Чикагском университете ДеПол.

Матросова сначала работала в JP Morgan в качестве финансового аналитика, а затем перешла в Beach Capital Management, где она достигла должности консультанта по инвестициям.

В 2012 году она поступила в дополнительную школу Гарвардского университета для изучения численного анализа, а в 2013 году получила степень магистра финансовой инженерии в Калифорнийском университете в школе бизнеса Haas в Беркли.

Вице-президент: Работа вдовца Чарли Фархуди в LinkedIn указана как вице-президент JP Morgan

Дань памяти: это изображение было размещено в Facebook в честь Матросовой, и друг назвал ее «энергичной душой»

После годичной стажировки в BNP Paribas она согласилась на роль партнера по кредитной торговле в августе 2014 года.

Судя по фотографиям в Facebook, она выглядела очень активной, с многочисленными фотографиями походов и рафтинга.Ее интересы указаны в LinkedIn как альпинизм, дзюдо и подводное плавание с аквалангом.

Друзья и родственники почтили память Матросовой в сети, разместив фотографии 32-летней девушки.

Один написал: «Покойся с миром …» с фотографией Матросовой, идущей по солнечному заснеженному лесу.

Другой описал ее как «живую душу».

На выходных в прибрежной части Новой Англии были выпущены часы для метели, которые коснулись окраины национального леса Уайт-Маунтин, который охватывает Президентский хребет.

В некоторых районах области выпало до 14 дюймов снега.

Расширение набора инструментов EasyClone-MarkerFree для генома Saccharomyces cerevisiae с новыми сайтами интеграции

FEMS Yeast Res. 2021 июн; 21 (4): foab027.

Махса Бабаи

Центр биологической устойчивости Novo Nordisk, Технический университет Дании, Kemitorvet Building 220, DK-2800 Kgs. Люнгбю, Дания

Луиза Сартори

Центр биологической устойчивости Novo Nordisk, Технический университет Дании, Kemitorvet Building 220, DK-2800 Kgs.Люнгбю, Дания

Алексей Карпухин

НИИ Аджиномото-генетика, Москва, Российская Федерация

Абашкин Дмитрий

НИИ Аджиномото-генетика, Москва, Российская Федерация

Елена Матросова

НИИ Аджиномото-генетика, Москва, Российская Федерация

Ирина Бородина

Центр биологической устойчивости Novo Nordisk, Технический университет Дании, Kemitorvet Building 220, DK-2800 Kgs.Люнгбю, Дания

Махса Бабаи, Центр биологической устойчивости Novo Nordisk, Технический университет Дании, Kemitorvet Building 220, DK-2800 Kgs. Люнгби, Дания;

Автор, ответственный за переписку: Центр биологической устойчивости Ново Нордиск, Технический университет Дании, здание Кемиторвет 220, DK-2800 Kgs. Люнгбю, Дания. Тел: +45 61775451; E-mail: [email protected]

Поступила в редакцию 6 января 2021 г .; Принято 22 апреля 2021 г.

Copyright © Автор (ы) 2021 г.Опубликовано Oxford University Press от имени FEMS. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение, и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. Эта статья цитируется в других статьях PMC.

РЕФЕРАТ

Биотехнологическое производство требует генетически стабильных рекомбинантных штаммов. Для обеспечения стабильности генома рекомбинантная ДНК обычно интегрируется в геном штамма-хозяина.Было разработано множество генетических инструментов для геномной интеграции в пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae . Ранее мы разработали векторный набор инструментов EasyClone-MarkerFree для стабильной интеграции в одиннадцать сайтов на хромосомах X, XI и XII S. cerevisiae . Безмаркерная интеграция была обеспечена системой CRISPR-Cas9. В этом исследовании мы расширили набор восемью дополнительными сайтами межгенной интеграции, расположенными на разных хромосомах. Эффективность интеграции в новые сайты составила более 80%.Уровень экспрессии белка зеленой флуоресценции ( gfp ) для всех восьми сайтов был аналогичным или выше сайта XI-2 из исходного набора инструментов EasyClone-MarkerFree. На рост клеток не повлияла интеграция ни в одно из восьми новых мест. Комплект расширения для восьми векторов доступен от AddGene.

Ключевые слова: хромосомная интеграция , CRISPR-Cas9, редактирование генома, метаболическая инженерия

ВВЕДЕНИЕ

Хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae — это модельный эукариотический организм (Nielsen 2019; Matthews and Vosshall 2020). Это также промышленная рабочая лошадка для производства различных химикатов, начиная от малоценных соединений в больших объемах, таких как этанол (Caspeta et al. , 2014), до высокоценных продуктов в небольших объемах, таких как инсулин (Liu et al .2012). Развитие промышленных штаммов обычно требует нескольких итерационных раундов редактирования генома и метаболической перестройки клетки-хозяина (Nielsen and Keasling, 2016). Следовательно, очень важно иметь генетические инструменты, позволяющие делать делеции, мутации и интеграции.Критическими требованиями к инструментарию интеграции являются: (i) стабильная хромосомная интеграция конструкций ДНК, (ii) высокий уровень экспрессии гетерологичных генов и (iii) отсутствие отрицательного воздействия на приспособленность и рост клеток (Gu et al .2015) .

Для удовлетворения этих требований наша группа ранее разработала векторный набор инструментов EasyClone MarkerFree (Jessop-Fabre и др. , 2016) для хромосомной интеграции нескольких генов в лабораторные и промышленные штаммы S. cerevisiae (Jensen et al .2014; Stovicek et al .2015) с использованием стандартизованных плазмид клонирования. Этот метод обеспечивает стабильную интеграцию и высокую экспрессию фрагментов в 11 отдельных сайтах, расположенных в межгенных областях в хромосомах X, XI и XII. Когда одна и та же кассета экспрессии гена была интегрирована в разные сайты, уровни экспрессии были сходными. Кроме того, сайты разделены основными генами, что предотвращает потерю интегрированных фрагментов в результате рекомбинации и обеспечивает стабильность штамма (Mikkelsen et al .2012). Маркеры отбора присутствуют только на двух эписомальных плазмидах, одна для экспрессии Cas9, а другая для экспрессии хелперной гРНК. Поскольку в геном не интегрированы маркеры селекции, можно последовательно редактировать несколько геномов без удаления маркеров селекции из генома. Для промышленного производства также важно, чтобы производственный штамм не содержал маркеров устойчивости к антибиотикам (Ramakrishnan et al . 2020).

В этом исследовании мы стремились расширить этот инструментарий за счет дополнительных проверенных сайтов интеграции, расположенных на разных хромосомах.Экспансия состоит из восьми векторов гРНК, нацеленных на определенные межгенные сайты, и из восьми соответствующих интегративных векторов, которые могут легко интегрироваться в эти сайты путем рекомбинации гомологов. Набор доступен в AddGene (депозит 78698).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Плазмиды

гРНК, нацеленные на единственный или множественный локус интеграции, были сконструированы, как описано ранее (Jessop-Fabre et al .2016). Координаты хромосом и нуклеотидные последовательности направляющих РНК перечислены в таблице S1 (вспомогательная информация), а несколько векторов гРНК — в таблице S2 (вспомогательная информация).Чтобы сконструировать плазмиды скелета, ок. Области выше и ниже целевого сайта интеграции (исключая последовательность PAM) длиной 400-600 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР (таблицы S5 и S6, вспомогательная информация). Фрагменты UP и DOWN затем клонировали по USER с терминаторами T adh2 -T cyc1 (BB4368) и векторным каркасом для размножения в E. coli (BB4367). Векторы, перечисленные в таблице S3 (вспомогательная информация), были проверены секвенированием по Сэнгеру (Eurofins, Германия).Чтобы подготовить интегративные векторы gfp , оптимизированный по кодонам белок gfp из Aequorea victoria (GenBank: {«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «AMY56666.1», «term_id»: «1018280714», «term_text»: «AMY56666.1»}} AMY56666.1) был клонирован в плазмиды остова в соответствии с рабочим процессом метода EasyClone-MarkerFree (Jessop-Fabre et al .2016) в векторы перечислены в Таблице S4 (Дополнительная информация).

Saccharomyces cerevisiae штамм CEN.PK113-7D, полученный от Peter Kötter (Entian and Kötter 2007), был использован в качестве основного штамма для проектирования и изготовления инструментария. Для экспрессии белка Cas9 вектор pCfB2312, содержащий репликон CEN / ARS (P tef1 -Cas9-T cyc1 _kanMX), Addgene # 78231, трансформировали в штамм CEN. PK113-7D и отбирали на средах, содержащих 200 мг / кг. L G418. Полученный штамм (ST7574) был использован в качестве родительского для всех следующих сконструированных штаммов. Вся трансформация дрожжей была выполнена методом с ацетатом лития с использованием 1-2 мкг интегративной плазмиды, расщепленной NotI и очищенной в геле, вместе с 500 нг вектора гРНК с использованием ранее описанного протокола (Jessop-Fabre et al .2016). Для проверки правильности интеграции векторов в целевой сайт применяли ПЦР колоний с использованием праймеров, перечисленных в таблице S7 (вспомогательная информация), с ДНК-полимеразой RedTaq® (VWR, Бельгия). Чтобы оценить рост клеток штаммов с интегрированной кассетой gfp в сайты Expanded-Easyclone, 8-10 одиночных колоний культивировали в минеральной среде объемом 500 мкл (Babaei et al .2020) с добавлением 20 г / л глюкозы в 96-м растворе. планшет с глубокими лунками. На следующий день клетки разводили 1: 100 в 96-половинном планшете с глубокими лунками, содержащем 300 мкл минеральной среды, и культивировали при встряхивании при 250 об / мин и 30 ° C в Growth Profiler 960 (EnzyScreen, Нидерланды). Культивирование продолжали в течение 40 часов для измерения профиля роста сконструированных штаммов. Для изучения стабильности сконструированных клеток культуру пассировали каждые 24 часа в свежую среду с разведением 1:50. Значения флуоресценции gfp и OD 600 были измерены с помощью ридера для микропланшетов BioTek Synergy MX при возбуждении при 485 нм и испускании при 530 нм для флуоресценции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При выборе новых сайтов интеграции в геноме S.cerevisiae рассматривались межгенные (некодирующие) области, отвечающие следующим критериям: (i) длиннее 1500 нуклеотидов, (ii) без автономной репликонной последовательности (ARS) и Ty-элементов и (iii) расположенные далеко от сантомера. и теломеры (Mikkelsen et al .2012). Были отобраны восемь потенциальных сайтов интеграции, отвечающих этим критериям, и названы по номеру хромосомы (таблица S1, вспомогательная информация), как II-1, IV-1 и т. Д. Затем были разработаны последовательности гРНК для нацеливания на эти сайты интеграции в S. cerevisiae штамм CEN.PK113-7D. Этот набор интегративных векторов экспрессии позволяет безмаркерную интеграцию одной или двух кассет экспрессии генов в каждый стандартизованный вектор клонирования (рис.). Рабочий процесс в расширенном наборе инструментов спроектирован так, чтобы быть похожим и совместимым с исходным набором инструментов EasyClone-MarkerFree, описанным Джессопом-Фабром и др. (Jessop-Fabre и др. .2016). Совместная трансформация плазмид gRNA вместе с NotI-линеаризованными интегративными векторами в дрожжевую клетку, экспрессирующую белок Cas9, приводит к интеграции кассеты в конкретный хромосомный участок.Для скрининга положительных трансформантов можно использовать быструю и надежную ПЦР дрожжевых колоний с использованием праймеров, перечисленных в таблице S7 (вспомогательная информация). Затем дрожжевые клетки с правильной интеграцией могут быть излечены от вектора пРНК, помещая клетки в неселективную среду, не содержащую нурсеотрицина. Если при этом будет сохранен отбор на Cas9-плазмиду с маркером устойчивости G418, то полученная клетка будет готова к следующему раунду интеграции. В конце штамм высевают на неселективную среду для удаления как гРНК, так и вектора Cas9.

Расширенный набор инструментов EasyClone-MarkerFree.

Проверка эффективности интеграции и уровня экспрессии генов для новых сайтов была выполнена путем интеграции gfp в каждый сайт. Для этого мы клонировали экспрессионную кассету gfp с двумя разными наборами промоторов-терминаторов; P tef1 gfp -T adh2 и P pgk1 gfp -T cyc1 , для получения интегративных плазмид (pCfB9365-pCfB9373 и pCfB10514-pCfB10421, соответственно; таблица). .В то же время мы также сконструировали штаммы с двойной и тройной вставкой интеграционных кассет gfp в разные сайты в одноэтапной трансформации. Чтобы сделать это позже, мы сконструировали несколько векторов gRNA, используя тот же метод, что и раньше (Jessop-Fabre et al .2016) (Таблица S2, дополнительная информация). Затем плазмиды интегрировали в штамм CEN. PK113-7D, экспрессирующий Cas9 (ST7574).

Для всех трансформаций мы проверяли, были ли плазмиды интегрированы в правильный сайт, случайным образом выбирая десять колоний и выполняя ПЦР колоний.Эффективность трансформации для всех исследованных сайтов с однократной и множественной интеграцией кассеты P tef1 gfp -T adh2 составляла не менее 8 из 10 колоний или выше, как показано на рис. Эти числа сопоставимы с исходными векторами EasyClone-MarkerFree (Jessop-Fabre et al .2016). Чтобы проверить эффективность выбранных последовательностей гРНК, мы также включили трансформации отрицательного контроля, проведенные только с вектором гРНК 500 нг и без ДНК для репарации.Для всех сайтов интеграции было получено очень мало колоний для отрицательных контролей.

Характеристика интегративных векторов, расширенных EasyClone. A ) Эффективность трансформации показана как количество клонов с правильно интегрированной ДНК из 10 случайно выбранных клонов. B ) Уровень экспрессии Ptef1-gfp- T adh2 , интегрированный в новые сайты для исходной флуоресцентной популяции и этих клеток после культивирования в течение ок. 60 поколений.Для сравнения показана экспрессия с сайта EasyClone XI-2. Приведенные значения флуоресценции являются средними для 8–10 повторов, при этом столбцы ошибок показывают стандартное отклонение между повторами. Статистический анализ был проведен для значений экспрессии gfp каждого штамма для исходного и 60-го поколений с использованием t-критерия Стьюдента (односторонняя, двухвыборочная неравная дисперсия; * p <0,05, ** p <0,01, * ** p <0,001).

Затем мы культивировали по крайней мере восемь клонов с правильно интегрированной кассетой P tef1 gfp -T adh2 для каждого одиночного и множественного вектора и измеряли флуоресценцию.Сайты интеграции, выбранные для расширенного набора инструментов, расположены в разных хромосомах, что отличается от исходного набора инструментов EasyClone с сайтами, расположенными на тех же хромосомах, но разделенными важными генетическими элементами. Поэтому, чтобы проверить, стабильны ли новые сайты, мы измерили уровень экспрессии gfp для сконструированных клеток из планшета для трансформации (называемого «исходной популяцией») и сравнили его с уровнем флуоресценции клеток после нескольких пассажей (чтобы достичь 60-го уровня. поколение).Уровни экспрессии gfp , как показано на фиг. Для всех исследованных сайтов интеграции, были сопоставимы или выше, чем у контрольного сайта EasyClone XI-2, с аддитивным эффектом двойной и тройной интеграции кассеты gfp во флуоресценции клеток (фиг.). Более того, когда мы сравнили уровень экспрессии gfp после нескольких пассажей флуоресцентных клеток с исходной популяцией, мы наблюдали небольшое снижение в четырех сайтах; 14% на участке II-1 ( p <0.01), 15% в сайте IX-1 ( p <0,001), 10% в сайте XV-1 ( p <0,01) и 9% в сайте XVI-1 ( p <0,05). Для клеток с множеством интегрированных gfp в любой из этих сайтов аналогичная тенденция к снижению флуоресценции наблюдалась после 60 поколений. Для других сайтов, включая Easyclone XI-2, снижение экспрессии gfp было незначительным ( p > 0,05). Хотя снижение экспрессии gfp в сайтах II-1, IX-1, XV-1 и XVI-1 не было резким, это наблюдение может быть полезно учитывать при конструировании штаммов для процессов с длительным культивированием.

Чтобы исследовать эффективность новых сайтов интеграции с использованием другой комбинации регуляторных элементов, мы сконструировали клетки с интеграционной кассетой gfp с конститутивным промотором P pgk1 и терминатором T cyc1 (P pgk1 gfp -T cyc1 ). Аналогично предыдущим результатам (рис., Для P tef1 gfp -T adh2 ), уровень экспрессии gfp для P pgk1 gfp -T cyc1 интеграция со всеми сайтами были аналогичны EasyClone XI-2 или выше, чем EasyClone XI-2 (рис.). При сравнении уровней экспрессии gfp между сайтами для двух различных промоторных конструкций (рис. S1, подтверждающая информация), сайты II-1, IV-1, VII-1 и VIII-1 давали стабильно более высокий уровень экспрессии, чем Сайт EasyClone XI-2, тогда как сайты XV-1 и XVI-1 приводили к тому же уровню экспрессии, что и сайт EasyClone XI-2. Однако экспрессия gfp в сайтах IX-1 и XIII-1 зависела от промотора. Поскольку уровень экспрессии белка зависит от многих факторов, помимо регуляторных элементов и сайта интеграции, необходимо эмпирически оптимизировать экспрессию.Затем, чтобы убедиться, что интеграция чужеродных элементов ДНК в исследуемые участки генома не влияет на рост клеток, мы также измерили последний и сравнили его с эталонным штаммом без каких-либо интеграций (рис.). За исключением штамма с gfp , интегрированным в сайт VII-1, который имел лаг-фазу на 2 часа дольше, все другие штаммы имели характеристики роста, аналогичные эталонному штамму (ST7574). Что касается максимальной удельной скорости роста (µ max ), показанной на рис., это значение для всех штаммов было аналогично контрольному штамму ( p > 0,05), за исключением штамма сайта VII-1 ( p <0,01). Поскольку трансформанты, используемые для анализа роста, не были излечены от вектора gRNA (несущего маркер устойчивости к антибиотикам NatMX), наблюдаемое более низкое значение µ max при росте для сайта VII-1 может быть получено после нескольких культивирований в неселективной среде.

A ) Уровень экспрессии P pgk1-gfp- T cyc1 , интегрированный в новые сайты для клеток после культивирования в течение ок.60 поколений. Для сравнения показана экспрессия с сайта EasyClone XI-2. B ) Профили роста штаммов со встроенной кассетой gfp по сравнению с нетрансформированным штаммом ST7574 в качестве эталона (ссылка). C ) Максимальные удельные скорости роста (µ max , h -1 ) для профилей роста штаммов в панели B. Статистический анализ был выполнен для значений µ max для каждого штамма и эталона с использованием t-критерия Стьюдента. (односторонние, двухвыборочные неравные дисперсии).

В заключение, векторы расширения предлагают ту же эффективность интеграции, уровни экспрессии и не влияют на рост, что и исходные векторы из набора инструментов EasyClone-MarkerFree. Мы надеемся, что они станут полезным дополнением к инструментам редактирования генома, доступным для конструирования S. cerevisiae .

ВКЛАД АВТОРОВ

IB и EM разработали исследование. AK и DA разработали элементы гРНК и провели предварительные испытания. МБ разработал набор плазмид и штаммов и выполнил эксперименты с профилем роста.LS сконструировал векторы и штаммы и провел анализ экспрессии gfp . МБ проанализировал данные и написал рукопись. Все авторы внесли свой вклад в написание и редактирование рукописи. IB и EM обеспечили финансирование и контролировали проект.

Дополнительные материалы

foab027_Supplemental_File

БЛАГОДАРНОСТЬ

Этот проект получил финансирование от программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020 в соответствии с соглашением о гранте No. 814408 (SHIKIFACTORY100). IB также благодарит за финансовую поддержку Фонда Ново Нордиск (Соглашение о гранте № NNF10CC1016517).

Информация для авторов

Махса Бабаи, Центр биологической устойчивости Novo Nordisk, Технический университет Дании, Kemitorvet Building 220, DK-2800 Kgs. Люнгбю, Дания.

Луиза Сартори, Центр биологической устойчивости Novo Nordisk, Технический университет Дании, Kemitorvet Building 220, DK-2800 Kgs.Люнгбю, Дания.

Алексей Карпухин, Научно-исследовательский институт Аджиномото-генетика, Москва, Российская Федерация.

Дмитрий Абашкин, Научно-исследовательский институт Аджиномото-генетика, Москва, Российская Федерация.

Елена Матросова, Научно-исследовательский институт Аджиномото-генетика, Москва, Российская Федерация.

Ирина Бородина, Центр биологической устойчивости Novo Nordisk, Технический университет Дании, Kemitorvet Building 220, DK-2800 Kgs. Люнгбю, Дания.

Конфликт интересов

Не заявлено.

ССЫЛКИ

  • Бабаи М., Боржа Замфир Г.М., Чен Ксет др. . Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства розмариновой кислоты. Синтетическая биология ACS. 2020; 9: 1978–88. DOi: 10.1021 / acssynbio.0c00048. [PubMed] [Google Scholar]
  • Caspeta L, Chen Y, Ghiaci Pet al. . Биотопливо. Измененный состав стеролов делает дрожжи термотолерантными. Наука. 2014; 346: 75–8. [PubMed] [Google Scholar]
  • Энтиан К. Д., Кёттер П. 25 Коллекции генетических штаммов и плазмид дрожжей.Стэнсфилд I, Старк MJ (ред.). Методы Microbiol. 2007; 36: 629–66. [Google Scholar]
  • Гу П, Ян Ф, Су Тет др. . Быстрая и надежная стратегия хромосомной интеграции множественных копий гена (ов). Научный доклад 2015; 5: 9684. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Дженсен Н.Б., Струко Т., Килдегаард К.Р. и др. . EasyClone: ​​метод итеративной хромосомной интеграции нескольких генов Saccharomyces cerevisiae . FEMS Yeast Res. 2014; 14: 238–48. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Jessop-Fabre MM, Jakočiūnas T, Stovicek Vet al.. EasyClone-MarkerFree: векторный набор инструментов для безмаркерной интеграции генов в Saccharomyces cerevisiae через CRISPR-Cas9. Biotechnol J. 2016; 11: 1110–7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Лю З., Тё КЭЙ, Мартинес Дж. И др. . Различные системы экспрессии для продукции рекомбинантных белков в Saccharomyces cerevisiae . Biotechnol Bioeng. 2012; 109: 1259–68. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Мэтьюз Б.Дж., Фоссхалл Л.Б. Как превратить организм в модельный за 10 «простых» шагов.J Exp Biol. 2020; 223: jeb218198. DOI: 10.1242 / jeb.218198. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Mikkelsen MD, Buron LD, Salomonsen Bet al. . Микробиологическое производство индолилглюкозинолата посредством разработки мультигенного пути на универсальной платформе экспрессии дрожжей. Metab Eng. 2012; 14: 104–11. [PubMed] [Google Scholar]
  • Нильсен Дж., Кислинг Дж. Д. Инженерный клеточный метаболизм. Клетка. 2016; 164: 1185–97. [PubMed] [Google Scholar]
  • Нильсен Дж. Системная биология дрожжей: модельный организм и клеточная фабрика.Биотехнология Ж. 2019; 14: 1800421. [PubMed] [Google Scholar]
  • Рамакришнан К., Праттипати М., Самуэль Пет и др. . Транскрипционный контроль экспрессии гена в Pichia pastoris путем манипулирования терминаторами. Appl Microbiol Biotechnol. 2020; 104: 7841–51. DOI: 10.1007 / s00253-020-10785-8. [PubMed] [Google Scholar]
  • Stovicek V, Borja GM, Forster Jet al. . EasyClone 2.0: расширенный набор интегративных векторов для стабильной экспрессии генов в промышленных штаммах Saccharomyces cerevisiae .J Ind Microbiol Biotechnol. 2015; 42: 1519–31. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Даша, Шон Арчер / from500px — Даша, Шон Арчер

Даша, Шон Арчер / from500px — Даша, Шон Арчер, . 6 октября 2018 richardsonian blogger. Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна. Пожалуйста, разместите фотографии для Дарьи или Даши Догушевой на этой странице списка: Великие истории Майка Руиса, Даши Матросовой, Ирвина Ривера, Виктории Арт, Геннадия Черномашинцева, Райана Купера, Бенджо Арваса, Людека Циганека, Шона Арчера и Райнера Ресманна Райнера Рессмана с саймоном чиркуланом и элиобом мофикеде в вене, австрия.Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы.

Таня Шон Арчер 511 41 imgp2698 G&G 423 49 img_7393 Windwing0032 148 1 Даша Шон Арчер 764 26 dsc2006140314 Люк Луо 144 4 портрет Максима Максимова 562 14 Хлоя Дэйва Виллемса 145 4 Поряйт Максим Максимов 45 королевство годафосс, исландия, патрик марсон онг. Шон лучник куцуу ханта нимелла даша. Зимняя страна чудес лаури лохи. Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы.

Даша — Шон Арчер на Fstoppers с cdn.fstoppers.com Следуй за мной на фейсбуке мой инстаграм в контакте личные онлайн уроки. Посмотреть все фотографии Даши Догушевой. Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна фотография райнера рессманна с саймоном циркуланом и элиоб мофикеде в вене, австралия. Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна фотография райнера рессманна с саймоном циркуланом и элиоб мофикеде в вене, австралия.Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы. Лучшие модные фотографы публикуются в журнале dodho. Автор Шон Арчер • Follow. Это невероятно просто и очень быстро.

Изучите эту фотографию под названием dasha, автор — sean archer (@seanarcher) на 500px

Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы. Тролльстигенская тропа розена велинова. Dasha by sean archer 380 42 dppa00011575 by 十三 葉 63 dsc_8924 by robin huang 602 8 gfx100s by alfa 林 153 dsc_8134 by johnny 137 dppa00010969 by 十三 葉 76 dsc_2058 by ivan warhammer 995 107 葉 月 yume momi 3 xt30.Вы действительно гений в своей работе, шон! Женщины, лицо, палец на губах, голубые глаза, шон арчер, короткие волосы, смотрит на зрителя, даша (модель), брюнетка, портрет, простой фон, водолазки, черный свитер. Изучите эту фотографию Шона Арчера (@seanarcher) под названием Даша на 500 пикселей. Если вы хотите увидеть больше захватывающих фотографий, загляните в популярный раздел нашей вкладки «Откройте для себя». Это невероятно просто и очень быстро. Скидка 70% на все мои уроки! Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна фотография райнера рессманна с саймоном циркуланом и элиоб мофикеде в вене, австралия.Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна. Это действительно просто и очень быстро. Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком).

Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком). Лучшие модные фотографы публикуются в журнале dodho. Шон лучник куцуу ханта нимелла даша. Я нашла свой способ ретуши, вы удивитесь, насколько это просто.Dasha by sean archer 380 42 dppa00011575 by 十三 葉 63 dsc_8924 by robin huang 602 8 gfx100s by alfa 林 153 dsc_8134 by johnny 137 dppa00010969 by 十三 葉 76 dsc_2058 by ivan warhammer 995 107 葉 月 yume momi 3 xt30.

Épinglé par Antonio Castillejo sur Sean Archer Photography … от i.pinimg.com Это невероятно просто и очень быстро. Чтобы увидеть больше красивых фотографий, посетите популярный раздел на нашей вкладке «Откройте для себя». Я нашла свой способ ретуши, вы удивитесь, насколько это просто.Погружение 2 Артура Станиша. Автор Шон Арчер • Follow. Я нашла свой способ ретуши, вы удивитесь, насколько это просто. Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы. Это невероятно просто и очень быстро.

Невероятно просто и очень быстро.

6 октября 2018 richardsonian blogger. Царство водопадов годафосса, исландия, патрик марсон онг. Даша, автор — Шон Арчер, пост 2956 на сайте 500px.com. Тролльстигенская тропа розена велинова.Изучите эту фотографию Шона Арчера (@seanarcher) под названием Даша на 500 пикселей. Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы. Чтобы увидеть больше красивых фотографий, посетите популярный раздел на нашей вкладке «Откройте для себя». Я просто зашел в фейсбук, и твоя страница понравилась. Посмотреть все фотографии Даши Догушевой. Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком). Автор Шон Арчер • Follow. Даша Шон Арчер 450 51 Таня Шон Арчер 541 43 Стася Шон Арчер 568 73 Настя Шон Арчер 568 26 Полина Шон Арчер 623 77 Лена Шон Арчер 472 48 Джулия Шон Арчер 635 46. Женщины, лицо, палец на губах, голубые глаза, шон арчер, короткие волосы, смотрит на зрителя, даша (модель), брюнетка, портрет, простой фон, водолазки, черный свитер.

• автор: vénus au miroir photography. Я не использую частотное разделение, маски и какие-либо сложные методы. Я просто зашел в фейсбук, и твоя страница понравилась. Это невероятно просто и очень быстро. Даша, автор — Шон Арчер, пост 2956 на сайте 500px.com.

500px / Шон Арчер из drscdn.500px.org Я поделюсь всем, что знаю о естественном свете, композиции, ретуши и цветах. Если вы хотите увидеть больше захватывающих фотографий, загляните в популярный раздел на нашей вкладке «Откройте для себя». Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы. • Автор: vénus au miroir photography. Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна.Таня Шон Арчер 511 41 imgp2698 G&G 423 49 img_7393 Windwing0032 148 1 Даша Шон Арчер 764 26 dsc2006140314 Люк Луо 144 4 Портрет Максима Максимова 562 14 Хлоя Дэйва Виллемса 145 4 Поряить Максим Максимов 451. Это действительно просто и очень быстро. Даша от Шона Арчера на 500px.com.

Красиво запечатлено, люблю мягкий свет на объект.

Невероятно просто и очень быстро. • Автор: vénus au miroir photography. Следуй за мной на фейсбуке мой инстаграм в контакте личные онлайн уроки.Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком). Надя, автор — Шон Арчер, пост 2958 на сайте 500px.com. Девушки, лицо, шон арчер, голубые глаза, даша (модель), портрет, простой фон, улыбается | 1900×1227 обои Женщины, лицо, палец на губах, голубые глаза, шон арчер, короткие волосы, смотрит на зрителя, даша (модель), брюнетка, портрет, простой фон, водолазки, черный свитер. Пожалуйста, разместите фотографии для Дарьи или Даши Догушевой на этой странице списка: Это действительно просто и очень быстро.Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы. Зимняя страна чудес лаури лохи. 6 октября 2018 richardsonian blogger. Царство водопадов годафосса, исландия, патрик марсон онг.

Источник: cdn.fstoppers.com

Женщины, лицо, палец на губах, голубые глаза, Шон Арчер, короткие волосы, смотрит на зрителя, даша (модель), брюнетка, портрет, простой фон, водолазки, черный свитер. Персональные онлайн-уроки и видеоуроки.Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком). Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна. Я не использую частотное разделение, маски и какие-либо сложные методы.

Источник: drscdn.500px.org

Красиво запечатлено, люблю мягкий свет на объект. Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком).Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна фотография райнера рессманна с саймоном циркуланом и элиоб мофикеде в вене, австралия. Пожалуйста, размещайте фотографии для Дарьи или Даши Догушевой на этой странице списка: Я не использую частотное разделение, маски и какие-либо сложные методы.

Источник: i.pinimg.com

Пожалуйста, разместите фотографии для Дарьи или Даши Догушевой на этой странице списка: Красиво запечатленные, люблю мягкий свет на предмет.Это действительно просто и очень быстро. Изучите эту фотографию под названием dasha, автор — sean archer (@seanarcher) на 500px White hairs, автор — stéphane tramoni.

Источник: i.pinimg.com

Чтобы увидеть больше красивых фотографий, посетите популярный раздел нашей вкладки «Узнай». Тролльстигенская тропа розена велинова. Пожалуйста, размещайте фотографии для Дарьи или Даши Догушевой на этой странице списка: Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы. Шон лучник куцуу ханта нимелла даша.

Источник: drscdn.500px.org

Myrskyhiiri, tulikomento, teräsvilla ja 2 muuta. Погружение 2 Артура Станиша. Белые волосы — Стефан Трамони. Это невероятно просто и очень быстро. Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы.

Источник: i.pinimg.com

Шон Арчер, фото / 500px 500px.com nuo alkuperäiset kuvat ovat sitten megakokoisia. Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы.Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна. Это невероятно просто и очень быстро. Мой топ-10 с красивой @dashka_sanatina 😍 какая твоя любимая?

Источник: ppcdn.500px.org

Изучите эту фотографию Шона Арчера (@seanarcher) под названием dasha на 500px Я нашел свой собственный способ ретуширования, вы удивитесь, насколько это просто.Это невероятно просто и очень быстро. Надя, автор — Шон Арчер, пост 2958 на сайте 500px.com. Мой топ-10 с красивой @dashka_sanatina 😍 какая твоя любимая?

Источник: i. pinimg.com

Шон Арчер, фото / 500px 500px.com nuo alkuperäiset kuvat ovat sitten megakokoisia. Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком). Это действительно просто и очень быстро. Я не использую частотное разделение, маски и какие-либо сложные методы. Следуй за мной на фейсбуке мой инстаграм в контакте личные онлайн уроки.

Источник: farm5.staticflickr.com

Я вообще не использую частотное разделение, маски, кривые и какие-либо сложные методы. Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком). Это невероятно просто и очень быстро. Посмотреть все фотографии Даши Догушевой. Великие рассказы майка руиса, даши матросовой, ирвина ривера, victoria art, геннадия черномашинцева, райана купера, бенджо арваса, людека циганека, шона арчера и райнера рессманна.

Источник: c1.staticflickr.com

Женщины, лицо, палец на губах, голубые глаза, шон арчер, короткие волосы, смотрит на зрителя, даша (модель), брюнетка, портрет, простой фон, водолазки, черный свитер.

Источник: lh5.googleusercontent.com

Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком).

Источник: drscdn.500px.org

Изучите эту фотографию под названием dasha, сделанную Шоном Арчером (@seanarcher) на 500px

Источник: 66.media.tumblr.com

Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком).

Источник: i.pinimg.com

Мой топ-10 с красивыми @dashka_sanatina 😍 какая из них ваша любимая?

Источник: c1.staticflickr.com

Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком).

Источник: i.pinimg.com

Невероятно просто и очень быстро.

Источник: i.pinimg.com

Невероятно просто и очень быстро.

Источник: i.pinimg.com

Невероятно просто и очень быстро.

Источник: live.staticflickr. com

Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком).

Источник: cdn.fstoppers.com

Тролльстигенская тропа Розена Велинова.

Источник: drscdn.500px.org

Надя, Шон Арчер, пост 2,958 на 500px.com.

Источник: cdn.fstoppers.com

Я нашел свой собственный способ ретуширования, вы удивитесь, насколько он прост.

Источник: i.pinimg.com

Даша, Шон Арчер, 380 42, dppa00011575, 十三 葉 63, dsc_8924, Робин Хуанг, 602, 8 gfx100s, Альфа, 153, dsc_8134, Джонни, 137, dppa00010969, Автор: Warhammer, 995, 76, dsc_20葉 月 ゆ め (hazuki yume) さ ん пользователя maomi m 41 3 xt30.

Источник: drscdn.500px.org

Я не использую частотное разделение, маски и какие-либо сложные методы.

Источник: s-media-cache-ak0.pinimg.com

«Белые волосы» — Стефан Трамони.

Источник: i.pinimg.com

Великие истории Майка Руиса, Даши Матросовой, Ирвина Ривера, Виктории Арт, Геннадия Черномашинцева, Райана Купера, Бенджо Арваса, Людека Циганека, Шона Арчера и Райнера Ресманна Райнера Рессмана фотография cirkulan и eliob mofikede в вене, австрия.

Источник: farm5.staticflickr.com

6 октября 2018 richardsonian blogger.

Источник: i.pinimg.com

Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком).

Источник: i.pinimg.com

Я не использую частотное разделение, маски и какие-либо сложные методы.

Источник: drscdn.500px.org

Это невероятно просто и очень быстро.

Источник: i.pinimg.com

Пожалуйста, разместите фотографии Дарьи или Даши Догушевой на этой странице списка:

Источник: drscdn.500px.org

Шон Арчер Куцуу Хянтя Нимелла даша.

Источник: 2.bp.blogspot.com

Даша Автор Шон Арчер на 500px.com пост 2,956.

Источник: www.beautifulmodels.xyz

Все, что вам нужно знать, это основы работы с фотошопом (вы можете быть абсолютным новичком).

Расширение набора инструментов EasyClone-MarkerFree для генома Saccharomyces cerevisiae с новыми сайтами интеграции | FEMS дрожжевое исследование

РЕФЕРАТ

Биотехнологическое производство требует генетически стабильных рекомбинантных штаммов. Для обеспечения стабильности генома рекомбинантная ДНК обычно интегрируется в геном штамма-хозяина. Было разработано множество генетических инструментов для геномной интеграции в пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae .Ранее мы разработали векторный набор инструментов EasyClone-MarkerFree для стабильной интеграции в одиннадцать сайтов на хромосомах X, XI и XII S. cerevisiae . Безмаркерная интеграция была обеспечена системой CRISPR-Cas9. В этом исследовании мы расширили набор восемью дополнительными сайтами межгенной интеграции, расположенными на разных хромосомах. Эффективность интеграции в новые сайты составила более 80%. Уровень экспрессии белка зеленой флуоресценции ( gfp ) для всех восьми сайтов был аналогичным или выше сайта XI-2 из исходного набора инструментов EasyClone-MarkerFree.На рост клеток не повлияла интеграция ни в одно из восьми новых мест. Комплект расширения для восьми векторов доступен от AddGene.

ВВЕДЕНИЕ

Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae — это модельный эукариотический организм (Nielsen 2019; Matthews and Vosshall 2020). Это также промышленная рабочая лошадка для производства различных химикатов, начиная от малоценных соединений в больших объемах, таких как этанол (Caspeta et al.2012). Развитие промышленных штаммов обычно требует нескольких итерационных раундов редактирования генома и метаболической перестройки клетки-хозяина (Nielsen and Keasling, 2016). Следовательно, очень важно иметь генетические инструменты, позволяющие делать делеции, мутации и интеграции. Критически важными требованиями для набора инструментов интеграции являются: (i) стабильная хромосомная интеграция конструкций ДНК, (ii) высокий уровень экспрессии гетерологичных генов и (iii) отсутствие отрицательного воздействия на приспособленность и рост клеток (Gu et al .2015).

Для удовлетворения этих требований наша группа ранее разработала векторный набор инструментов EasyClone MarkerFree (Jessop-Fabre et al , 2016) для хромосомной интеграции нескольких генов в лабораторные и промышленные штаммы S. cerevisiae (Jensen et al. .2014; Stovicek et al .2015) с использованием стандартизованных плазмид для клонирования. Этот метод обеспечивает стабильную интеграцию и высокую экспрессию фрагментов в 11 отдельных сайтах, расположенных в межгенных областях в хромосомах X, XI и XII.Когда одна и та же кассета экспрессии гена была интегрирована в разные сайты, уровни экспрессии были сходными. Более того, сайты разделены основными генами, что предотвращает потерю интегрированных фрагментов в результате рекомбинации и обеспечивает стабильность штамма (Mikkelsen et al .2012). Маркеры отбора присутствуют только на двух эписомальных плазмидах, одна для экспрессии Cas9, а другая для экспрессии хелперной гРНК. Поскольку в геном не интегрированы маркеры селекции, можно последовательно редактировать несколько геномов без удаления маркеров селекции из генома.Для промышленного производства также важно, чтобы производственный штамм не содержал маркеров устойчивости к антибиотикам (Ramakrishnan et al .2020).

В этом исследовании мы стремились расширить этот инструментарий за счет дополнительных проверенных сайтов интеграции, расположенных на разных хромосомах. Экспансия состоит из восьми векторов гРНК, нацеленных на определенные межгенные сайты, и из восьми соответствующих интегративных векторов, которые могут легко интегрироваться в эти сайты путем рекомбинации гомологов.Набор доступен в AddGene (депозит 78698).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды

гРНК, нацеленные на один или несколько локусов интеграции, были сконструированы, как описано ранее (Jessop-Fabre et al .2016). Координаты хромосом и нуклеотидные последовательности направляющих РНК перечислены в таблице S1 (вспомогательная информация), а несколько векторов гРНК — в таблице S2 (вспомогательная информация). Чтобы сконструировать плазмиды скелета, ок. Области выше и ниже целевого сайта интеграции (исключая последовательность PAM) длиной 400-600 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР (таблицы S5 и S6, вспомогательная информация).Фрагменты UP и DOWN затем клонировали по USER с терминаторами T adh2 -T cyc1 (BB4368) и векторным каркасом для размножения в E. coli (BB4367). Векторы, перечисленные в таблице S3 (вспомогательная информация), были проверены секвенированием по Сэнгеру (Eurofins, Германия). Для получения интегративных векторов gfp оптимизированный по кодонам белок gfp из Aequorea victoria (GenBank: AMY56666.1) был клонирован в плазмиды остова в соответствии с рабочим процессом метода EasyClone-MarkerFree (Jessop-Fabre et al .2016) к векторам, перечисленным в таблице S4 (вспомогательная информация).

Saccharomyces cerevisiae штамм CEN.PK113-7D, полученный от Peter Kötter (Entian and Kötter 2007), был использован в качестве основного штамма для проектирования и создания инструментария. Для экспрессии белка Cas9 вектор pCfB2312, содержащий репликон CEN / ARS (P tef1 -Cas9-T cyc1 _kanMX), Addgene # 78231, трансформировали в штамм CEN.PK113-7D и отбирали на средах, содержащих 200 мг / кг. L G418. Полученный штамм (ST7574) был использован в качестве родительского для всех следующих сконструированных штаммов.Вся трансформация дрожжей была выполнена методом с ацетатом лития с использованием 1-2 мкг интегративной плазмиды, расщепленной NotI и очищенной в геле, вместе с 500 нг вектора гРНК с использованием ранее описанного протокола (Jessop-Fabre et al . 2016. ). Для проверки правильности интеграции векторов в целевой сайт применяли ПЦР колоний с использованием праймеров, перечисленных в таблице S7 (вспомогательная информация), с ДНК-полимеразой RedTaq® (VWR, Бельгия). Чтобы оценить рост клеток штаммов с интегрированной кассетой gfp в сайты Expanded-Easyclone, 8-10 одиночных колоний культивировали в 500 мкл минеральной среды (Babaei et al .2020) с добавлением 20 г / л глюкозы в 96-луночном планшете. На следующий день клетки разводили 1: 100 в 96-половинном планшете с глубокими лунками, содержащем 300 мкл минеральной среды, и культивировали при встряхивании при 250 об / мин и 30 ° C в Growth Profiler 960 (EnzyScreen, Нидерланды). Культивирование продолжали в течение 40 часов для измерения профиля роста сконструированных штаммов. Для изучения стабильности сконструированных клеток культуру пассировали каждые 24 часа в свежую среду с разведением 1:50. Значения флуоресценции gfp и OD 600 были измерены с помощью ридера для микропланшетов BioTek Synergy MX при возбуждении при 485 нм и испускании при 530 нм для флуоресценции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При выборе новых сайтов интеграции в геноме S. cerevisiae учитывались межгенные (некодирующие) области, отвечающие следующим критериям: (i) длиннее 1500 нуклеотидов, (ii) без автономной репликонной последовательности (ARS). ) и Ty-элементы и (iii) расположены далеко от сантомера и теломер (Mikkelsen et al .2012). Были отобраны восемь потенциальных сайтов интеграции, отвечающих этим критериям, и названы по номеру хромосомы (таблица S1, вспомогательная информация), как II-1, IV-1 и т. Д.Затем были сконструированы последовательности пРНК для нацеливания на эти сайты интеграции в штамме S. cerevisiae CEN.PK113-7D. Этот набор интегративных векторов экспрессии позволяет безмаркерную интеграцию одной или двух кассет экспрессии генов в каждый стандартизованный вектор клонирования (рис. 1). Рабочий процесс в расширенном наборе инструментов спроектирован так, чтобы быть похожим и совместимым с исходным набором инструментов EasyClone-MarkerFree, описанным Джессопом-Фабром и др. (Jessop-Fabre и др. .2016). Совместная трансформация плазмид gRNA вместе с NotI-линеаризованными интегративными векторами в дрожжевую клетку, экспрессирующую белок Cas9, приводит к интеграции кассеты в конкретный хромосомный участок.Для скрининга положительных трансформантов можно использовать быструю и надежную ПЦР дрожжевых колоний с использованием праймеров, перечисленных в таблице S7 (вспомогательная информация). Затем дрожжевые клетки с правильной интеграцией могут быть излечены от вектора пРНК, помещая клетки в неселективную среду, не содержащую нурсеотрицина. Если при этом будет сохранен отбор на Cas9-плазмиду с маркером устойчивости G418, то полученная клетка будет готова к следующему раунду интеграции. В конце штамм высевают на неселективную среду для удаления как гРНК, так и вектора Cas9.

Рисунок 1.

Расширенный инструментарий EasyClone-MarkerFree.

Рисунок 1.

Расширенный набор инструментов EasyClone-MarkerFree.

Проверка эффективности интеграции и уровня экспрессии генов для новых сайтов была выполнена путем интеграции gfp в каждый сайт. Для этого мы клонировали экспрессионную кассету gfp с двумя разными наборами промоторов-терминаторов; P tef1 gfp -T adh2 и P pgk1 gfp -T cyc1 , для получения интегративных плазмид (pCfB9365-pCfB9373 и pCfB10514-pCfB10421, соответственно; таблица). .В то же время мы также сконструировали штаммы с двойной и тройной вставкой интеграционных кассет gfp в разные сайты в одноэтапной трансформации. Чтобы сделать это позже, мы сконструировали несколько векторов gRNA, используя тот же метод, что и раньше (Jessop-Fabre et al .2016) (Таблица S2, дополнительная информация). Затем плазмиды интегрировали в штамм CEN.PK113-7D, экспрессирующий Cas9 (ST7574).

Для всех трансформаций мы проверяли, были ли плазмиды интегрированы в правильный сайт, случайным образом выбирая десять колоний и выполняя ПЦР колоний.Эффективность трансформации для всех исследованных сайтов с однократной и множественной интеграцией кассеты P tef1 gfp -T adh2 составляла не менее 8 из 10 колоний или выше, как показано на фиг. 2A. Эти числа сопоставимы с исходными векторами EasyClone-MarkerFree (Jessop-Fabre et al .2016). Чтобы проверить эффективность выбранных последовательностей гРНК, мы также включили трансформации отрицательного контроля, проведенные только с вектором гРНК 500 нг и без ДНК для репарации.Для всех сайтов интеграции было получено очень мало колоний для отрицательных контролей.

Рисунок 2.

Характеристика интегративных векторов, расширенных EasyClone. A ) Эффективность трансформации показана как количество клонов с правильно интегрированной ДНК из 10 случайно выбранных клонов. B ) Уровень экспрессии Ptef1-gfp- T adh2 , интегрированный в новые сайты для исходной флуоресцентной популяции и этих клеток после культивирования в течение ок.60 поколений. Для сравнения показана экспрессия с сайта EasyClone XI-2. Приведенные значения флуоресценции являются средними для 8–10 повторов, при этом столбцы ошибок показывают стандартное отклонение между повторами. Статистический анализ был проведен для значений экспрессии gfp каждого штамма для исходного и 60-го поколений с использованием t-критерия Стьюдента (односторонняя, двухвыборочная неравная дисперсия; * p <0,05, ** p <0,01, * ** p <0,001).

Рисунок 2.

Характеристика интегративных векторов, расширенных EasyClone. A ) Эффективность трансформации показана как количество клонов с правильно интегрированной ДНК из 10 случайно выбранных клонов. B ) Уровень экспрессии Ptef1-gfp- T adh2 , интегрированный в новые сайты для исходной флуоресцентной популяции и этих клеток после культивирования в течение ок. 60 поколений. Для сравнения показана экспрессия с сайта EasyClone XI-2. Приведенные значения флуоресценции являются средними для 8–10 повторов, при этом столбцы ошибок показывают стандартное отклонение между повторами.Статистический анализ был проведен для значений экспрессии gfp каждого штамма для исходного и 60-го поколений с использованием t-критерия Стьюдента (односторонняя, двухвыборочная неравная дисперсия; * p <0,05, ** p <0,01, * ** p <0,001).

Затем мы культивировали по крайней мере восемь клонов с правильно интегрированной кассетой P tef1 gfp -T adh2 для каждого одиночного и множественного вектора и измеряли флуоресценцию. Сайты интеграции, выбранные для расширенного набора инструментов, расположены в разных хромосомах, что отличается от исходного набора инструментов EasyClone с сайтами, расположенными на тех же хромосомах, но разделенными важными генетическими элементами.Поэтому, чтобы проверить, стабильны ли новые сайты, мы измерили уровень экспрессии gfp для сконструированных клеток из планшета для трансформации (называемого «исходной популяцией») и сравнили его с уровнем флуоресценции клеток после нескольких пассажей (чтобы достичь 60-го уровня. поколение). Уровни экспрессии gfp , как показано на фиг.2B, для всех исследованных сайтов интеграции были сопоставимы или выше, чем у контрольного сайта EasyClone XI-2, с аддитивным эффектом двойной и тройной интеграции кассеты gfp во флуоресценции клеток (фиг.2Б). Более того, когда мы сравнили уровень экспрессии gfp после нескольких пассажей флуоресцентных клеток с исходной популяцией, мы наблюдали небольшое снижение в четырех сайтах; 14% на участке II-1 ( p <0,01), 15% на участке IX-1 ( p <0,001), 10% на участке XV-1 ( p <0,01) и 9% на участке XVI-1 ( p <0,05). Для клеток с множеством интегрированных gfp в любой из этих сайтов аналогичная тенденция к снижению флуоресценции наблюдалась после 60 поколений.Для других сайтов, включая Easyclone XI-2, снижение экспрессии gfp было незначительным ( p > 0,05). Хотя снижение экспрессии gfp в сайтах II-1, IX-1, XV-1 и XVI-1 не было резким, это наблюдение может быть полезно учитывать при конструировании штаммов для процессов с длительным культивированием.

Чтобы исследовать эффективность новых сайтов интеграции с использованием другой комбинации регуляторных элементов, мы сконструировали клетки с интеграционной кассетой gfp с конститутивным промотором P pgk1 и терминатором T cyc1 (P pgk1 gfp -T cyc1 ).Аналогично предыдущим результатам (рис. 2B, для P tef1 gfp -T adh2 ), уровень экспрессии gfp для P pgk1 gfp -T cyc1 интеграция со всеми сайты были подобны или выше, чем у EasyClone XI-2 (фиг. 3A). При сравнении уровней экспрессии gfp между сайтами для двух различных промоторных конструкций (рис. S1, подтверждающая информация), сайты II-1, IV-1, VII-1 и VIII-1 давали стабильно более высокий уровень экспрессии, чем Сайт EasyClone XI-2, тогда как сайты XV-1 и XVI-1 приводили к тому же уровню экспрессии, что и сайт EasyClone XI-2.Однако экспрессия gfp в сайтах IX-1 и XIII-1 зависела от промотора. Поскольку уровень экспрессии белка зависит от многих факторов, помимо регуляторных элементов и сайта интеграции, необходимо эмпирически оптимизировать экспрессию. Затем, чтобы убедиться, что интеграция чужеродных элементов ДНК в исследуемые участки генома не влияет на рост клеток, мы также измерили последний и сравнили его с эталонным штаммом без каких-либо интеграций (рис. 3B).За исключением штамма с gfp , интегрированным в сайт VII-1, который имел лаг-фазу на 2 часа дольше, все другие штаммы имели характеристики роста, аналогичные эталонному штамму (ST7574). Что касается максимальной удельной скорости роста (µ max ), показанной на фиг. 3C, это значение для всех штаммов было аналогично контрольному штамму ( p > 0,05), за исключением штамма сайта VII-1 ( p <0,01). Поскольку трансформанты, используемые для анализа роста, не были излечены от вектора gRNA (несущего маркер устойчивости к антибиотикам NatMX), наблюдаемое более низкое значение µ max при росте для сайта VII-1 может быть получено после нескольких культивирований в неселективной среде.

Рисунок 3.

A ) Уровень экспрессии P pgk1- gfp- T cyc1 , интегрированный в новые сайты для клеток после культивирования в течение ок. 60 поколений. Для сравнения показана экспрессия с сайта EasyClone XI-2. B ) Профили роста штаммов со встроенной кассетой gfp по сравнению с нетрансформированным штаммом ST7574 в качестве эталона (ссылка). C ) Максимальные удельные скорости роста (µ max , h -1 ) для профилей роста штаммов в панели B.Статистический анализ был выполнен для значений µ max для каждого штамма и эталона с использованием t-критерия Стьюдента (односторонние неравные дисперсии для двух выборок).

Рисунок 3.

A ) Уровень экспрессии P pgk1- gfp- T cyc1 , интегрированный в новые сайты для клеток после культивирования в течение ок. 60 поколений. Для сравнения показана экспрессия с сайта EasyClone XI-2. B ) Профили роста штаммов со встроенной кассетой gfp по сравнению с нетрансформированным штаммом ST7574 в качестве эталона (ссылка). C ) Максимальные удельные скорости роста (µ max , h -1 ) для профилей роста штаммов в панели B. Статистический анализ был выполнен для значений µ max для каждого штамма и эталона с использованием t-критерия Стьюдента. (односторонние, двухвыборочные неравные дисперсии).

В заключение, векторы расширения предлагают ту же эффективность интеграции, уровни экспрессии и не влияют на рост, что и исходные векторы из набора инструментов EasyClone-MarkerFree. Мы надеемся, что они станут полезным дополнением к инструментам редактирования генома, доступным для разработки S.cerevisiae .

ВКЛАД АВТОРОВ

IB и EM разработали исследование. AK и DA разработали элементы гРНК и провели предварительные испытания. МБ разработал набор плазмид и штаммов и выполнил эксперименты с профилем роста. LS сконструировал векторы и штаммы и провел анализ экспрессии gfp . МБ проанализировал данные и написал рукопись. Все авторы внесли свой вклад в написание и редактирование рукописи. IB и EM обеспечили финансирование и контролировали проект.

БЛАГОДАРНОСТИ

Этот проект получил финансирование в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020 в соответствии с соглашением о гранте № 814408 (SHIKIFACTORY100). IB также благодарит за финансовую поддержку Фонда Ново Нордиск (Соглашение о гранте № NNF10CC1016517).

Конфликт интересов

Не объявлено.

ССЫЛКИ

Babaei

M

,

Borja Zamfir

GM

,

Chen

X

et al.

Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства розмариновой кислоты

.

ACS Synthetic Biology

.

2020

;

9

:

1978

88

. DOi: 10.1021 / acssynbio.0c00048.

Caspeta

L

,

Chen

Y

,

Ghiaci

P

et al.

Биотопливо. Измененный состав стеролов делает дрожжи термотолерантными

.

Наука

.

2014

;

346

:

75

8

.

Entian

K-D

,

Kötter

P

.

25 коллекций дрожжевых генетических штаммов и плазмид

.

Stansfield

I

,

Stark

MJ

(ред.).

Методы Микробиол

.

2007

;

36

:

629

66

.

Gu

P

,

Yang

F

,

Su

T

et al.

Быстрая и надежная стратегия хромосомной интеграции гена (ов) с множеством копий

.

Научный сотрудник

.

2015

;

5

:

9684

.

Jensen

NB

,

Strucko

T

,

Kildegaard

KR

et al.

EasyClone: ​​метод итеративной хромосомной интеграции нескольких генов Saccharomyces cerevisiae

.

FEMS дрожжи Res

.

2014

;

14

:

238

48

.

Jessop-Fabre

MM

,

Jakočiūnas

T

,

Stovicek

V

et al.

EasyClone-MarkerFree: векторный набор инструментов для безмаркерной интеграции генов в Saccharomyces cerevisiae через CRISPR-Cas9

.

Биотехнология J

.

2016

;

11

:

1110

7

.

Liu

Z

,

Tyo

KEJ

,

Martínez

JL

et al.

Различные системы экспрессии для продукции рекомбинантных белков в Saccharomyces cerevisiae

.

Биотехнология Биоенг

.

2012

;

109

:

1259

68

.

Мэтьюз

BJ

,

Vosshall

LB

.

Как превратить организм в модельный за 10 «простых» шагов

.

Дж Эксп Биол

.

2020

;

223

:

jeb218198

. DOI:.

Mikkelsen

MD

,

Buron

LD

,

Salomonsen

B

et al.

Микробиологическое производство индолилглюкозинолата путем конструирования мультигенного пути на универсальной платформе экспрессии дрожжей

.

Metab Eng

.

2012

;

14

:

104

11

.

Nielsen

J

,

Keasling

JD

.

Инженерия клеточного метаболизма

.

Ячейка

.

2016

;

164

:

1185

97

.

Нильсен

Дж

.

Биология дрожжевых систем: модельный организм и фабрика клеток

.

Биотехнология J

.

2019

;

14

:

1800421

.

Рамакришнан

K

,

Праттипати

M

,

Samuel

P

et al.

Транскрипционный контроль экспрессии гена в Pichia pastoris путем манипулирования терминаторами

.

Приложение Microbiol Biotechnol

.

2020

;

104

:

7841

51

.DOI:.

Stovicek

V

,

Borja

GM

,

Forster

J

et al.

EasyClone 2.0: расширенный набор интегративных векторов для стабильной экспрессии генов в промышленных штаммах Saccharomyces cerevisiae

.

Дж Ind Microbiol Biotechnol

.

2015

;

42

:

1519

31

.

© Автор (ы) 2021. Опубликовано Oxford University Press от имени FEMS.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно цитируется.

Катя Матросова замерзает насмерть в походе по Белым горам

КАТЕ Матросова, 32 года, была оставлена ​​мужем для похода, который должен был быть обычным. Через несколько часов она включила аварийный радиомаяк.

Женщина из Нью-Йорка умерла в одиночестве в походе при отрицательных температурах и ветре 160 км / ч в горах Нью-Гэмпшира.

Кейт Матросова, 32 года, была найдена мертвой в понедельник, по всей видимости, в результате разоблачения, через день после того, как она пропала без вести в Белых горах.

Матросова, родившаяся в Сибири, была найдена между горами Мэдисон и Маунт Адамс, на серии вершин под названием Президентский хребет, Как сообщает New York Post.

По данным ее профиля в LinkedIn, предприимчивая молодая женщина работала в сфере торговли кредитами в банковской фирме BNP Paribas в центре Манхэттена.

Ее муж, вице-президент JPMorgan Chase, высадил ее рано утром в воскресенье у подножия гор, где она планировала подняться на гору Вашингтон, самую высокую вершину на северо-востоке.

К полудню воскресенья Матросова активировала аварийный радиомаяк, который отправил ее координаты спасателям.

Но поисковым командам не удалось ее найти.

«К сожалению, многие координаты, которые мы получили за ночь, находились повсюду в пределах мили», — лейтенант.Об этом WMUR-TV сообщил Джим Госс из Департамента рыболовства и охоты штата.

Ночью температура упала до 30 градусов ниже нуля, а ветер дул со скоростью более 160 км / ч.

Спасательная команда, в состав которой входили сотрудники службы рыбной ловли и охоты, сотрудники горно-спасательной службы и поисково-спасательные службы Андроскоггин-Вэлли, в понедельник устояла перед ветрами, чтобы добраться до этого района.

«Я думаю, если вы собираетесь отправиться в поход в такую ​​погоду, вам нужно находиться в более защищенном месте, а не на открытой, открытой линии гребня», — сказал Госс.

«В таком месте просто нет места для ошибки».

На фотографиях амбициозной альпинистки, размещенных в социальных сетях, видно, как она преодолевает препятствия на пересеченной местности по всему миру, в том числе в холодных тундрах.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.